光学显微镜的原理
光学显微镜的原理是,将光照射在观察对象上,通过物镜将透过或反射的对象光线进行放大。
观察者看到的是目标物体的光(像)经过物镜放大,然后经过目镜再次放大成虚像。光学显微镜的放大倍率是物镜和目镜的放大倍率相乘的结果。倍率越高,可以更大程度地放大观察目标。
显微镜根据照明方式的不同,可以分为两大类:「透射型」和「反射型」。在透射型中,显微镜用于观察细胞或细菌等生物试样这类可以透光的物体,而在反射型中,则用于观察金属或半导体等不透光的物体。此外,还可以根据观察试样的方向进行分类,有将物镜置于上方的正立式和将物镜置于下方的倒立式。特别地,在烧杯中培养的样品需要从下方观察,因此使用倒立式显微镜。图中展示了最受欢迎的正立透射型显微镜的概要图。
光学显微镜的光学放大倍率由物镜和目镜的倍率决定。在光学显微镜的观察中,不仅仅是放大倍率,分辨率和对比度也是重要的因素。
分解能是指能够识别两个不同点的最小距离(δ),它表示能够识别的细节程度。对于显微镜,分解能由物镜的数值孔径(NA)和光波长(λ)决定,并可用以下公式表示。
δ = kλ/NA (k是常数)
开口数NA通过n×sinθ计算,n是物镜与介质之间的折射率,θ是入射到物镜的光线相对于光轴的最大角度。
接下来,解释对比度。
生物样本等通常都是透明的,如果直接观察样本,可能会变得透明,无法识别结构。在这种情况下,需要通过染色或调整光线等来调整观察条件。通过染色和光线调整,在图像中增加对比度,使观察对象更易于观察。
近年来,除了染色和绞染的调整之外,利用光的散射和衍射、荧光的观察方法也已经确立,这些观察方法被称为相位差或微分干涉。专门针对这些观察方法的光学显微镜也存在,光学显微镜中相位差显微镜和微分干涉显微镜。对细胞等进行染色时,细胞会死亡,但使用相位差显微镜和微分干涉显微镜可以观察到活细胞。